薬剤師国家試験 平成30年度 第103回 - 一般 理論問題 - 問 119,120

未知タンパク質Ｘを分離精製し、その特性を解析した。

問119
タンパク質Ｘを含む細胞抽出液（試料ア）をドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS−PAGE）及びサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）により分析した。SDS−PAGEに際し、試料アにSDSと2−メルカプトエタノールを添加して前処理した（試料イ）。図1のレーンＡは分子量が25 kDa、35 kDa、40 kDa、55 kDaの4種の分子量マーカータンパク質を示し、レーンＢは試料イを分離したときの泳動結果である。図2は精製したタンパク質Ｘ溶液（試料ウ）と上記の4種の分子量マーカータンパク質を混合して分離したときのクロマトグラムである。以下の記述のうち、正しいのはどれか。２つ選べ。

１　SDS−PAGEでは、試料イのようにタンパク質をSDSと2−メルカプトエタノールで酸化的に前処理することで分子量に基づいた分離が可能になる。
２　SDS−PAGEにおいて、タンパク質は陰極から陽極に向かって移動する。
３　タンパク質Ｘの分子量は、40 kDaから55 kDaの間である。
４　SECの固定相として、プロテインA固定化シリカゲルが用いられる。
５　SECによりタンパク質Ｘが単量体として溶出されるとき、そのピークは④である。


問120
精製したタンパク質Ｘは単量体で酵素活性をもち、その活性発現には補因子を必要としないことが判明した。次に、タンパク質Ｘに対する1種類のモノクローナル抗体（anti−Ｘ）をマウスを用いて作製した。タンパク質Ｘの酵素活性、抗体作製及び細胞内局在の解析に関する記述のうち、正しいのはどれか。２つ選べ。ただし、精製の過程で酵素活性が失われることはなかった。

１　試料イにおけるタンパク質Ｘの酵素活性は、試料アよりも高い。
２　タンパク質Ｘの比活性＊は、試料アよりも試料ウにおいて高い。
３　anti−Ｘを産生するハイブリドーマの作製には、マウス骨髄腫細胞が用いられる。
４　anti−Ｘは、タンパク質Ｘ中の複数の異なるエピトープ（抗原決定基）を認識する。
５　anti−Ｘと試料イを用いたウエスタンブロット法により、タンパク質Ｘの細胞内局在を同定することができる。

＊比活性：試料中のタンパク質の単位重量当たりの酵素活性

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問119　解答　２、３

本問は、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（SDS−PAGE）とサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）の2つの分析法が用いられており、図１ではSDS−PAGEの分析結果、図２ではSECの分析結果を表している。
SDS−PAGEは、ポリアクリルアミドゲルを用いてタンパク質の分子量（分子サイズ）の違いで分離する方法である。分離の前処理として、還元剤の2−メルカプトエタノールと陰イオン性界面活性剤のSDSを添加する。2−メルカプトエタノールによりタンパク質を還元的に前処理することで、ジスルフィド結合を切断し直鎖状ペプチドとする。SDSにより、直鎖状ペプチドの疎水部分にSDS分子が疎水結合し、直鎖状ペプチドは負に荷電する。上記の前処理後、ポリアクリルアミドゲル中での移動度により分子量の違いで分離をすることができる。このとき、試料は陰極から陽極に泳動し、分子量の小さい成分ほど移動度は大きい。
SECは、固定相に分子ふるい効果をもつ多孔性ゲルを用いて、アミノ酸、タンパク質などを分子量の違いにより分離する方法である。多孔性ゲルを用いると小さな分子はゲルの内部に侵入するが、大きな分子はゲルの外側を通り抜ける。そのため、ゲルの内部に侵入しない分子量の大きな成分は、分子量の小さい成分に比べてカラムから早く溶出する。

１　誤
SDS−PAGEでは、タンパク質をSDSと2−メルカプトエタノールで還元的に前処理することで分子量に基づいた分離が可能になる。

２　正
上記参照

３　正
SDS−PAGEでは分子量の小さい成分ほど移動度は大きくなる。そのため、図１のレーンAの4種の分子量マーカータンパク質は、55 kDa、40 kDa、35 kDa、25 kDaの順に移動度は大きくなる。下図で示すとおり、タンパク質Ｘは、55 kDaと40 kDaの間に分離されていることから分子量は、40 kDaから55 kDaの間である。


４　誤
SECは、固定相に多孔性ゲルを用いる。なお、プロテインA固定化シリカゲルを用いるのはアフィニティークロマトグラフィーである。

５　誤
SECは、分子量の大きな成分ほどカラムから早く溶出する（保持時間が小さい）。そのため、タンパク質Ｘの単量体と25 kDa、35 kDa、40 kDa、55 kDaの4種の分子量マーカータンパク質を混合して分離したとき、55 kDa（①）、タンパク質Ｘの単量体（②）、40 kDa（③）、35 kDa（④）、25 kDa（⑤）の順にカラムから溶出する。よって、タンパク質Ｘの単量体のピークは②である。


問120　解答　２、３

１　誤
試料イは、試料アが還元剤の2−メルカプトエタノールや陰イオン性界面活性剤のSDSを添加して前処理されることで、ジスルフィド結合の切断などによりタンパク質が変性しているため、酵素活性が低下している。そのため、試料イにおけるタンパク質Ｘの酵素活性は、試料アよりも低い。

２　正
試料アはタンパク質Ｘを含む細胞抽出液であり、タンパク質Ｘ以外のタンパク質が混入している。一方、試料ウは、SECによる分離が行われており、タンパク質Ｘのみを精製した試料となっている。そのため、比活性（試料中のタンパク質の単位重量当たりの酵素活性）は試料アよりも純度が高い試料ウにおいて高い。

３　正
ハイブリドーマとは、複数の細胞が融合してできた融合細胞のことである。一般的にモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、B細胞と骨髄腫細胞を融合させて作製する。B細胞は抗体産生能をもつが寿命が短いため、目的とするモノクローナル抗体を産生することができても、その抗体を産生させ続けることができない。そこで、抗体産生能をもつB細胞と無限増殖能を持った骨髄腫細胞を融合させることで、目的とするモノクローナル抗体の継続的な産生が可能となったハイブリドーマを作製することができる。本設問では、「タンパク質Ｘに対する1種類のモノクローナル抗体（anti−Ｘ）をマウスを用いて作製した。」と記述があるため、anti−Ｘを産生するハイブリドーマの作製には、マウス骨髄腫細胞が用いられる。

４　誤
anti−Ｘはモノクローナル抗体のため、タンパク質Ｘ中の一種類のエピトープ（抗原決定基）だけを認識する。なお、複数の異なるエピトープ（抗原決定基）を認識する抗体集団をポリクローナル抗体という。

５　誤
ウエスタンブロット法によるタンパク質の細胞内局在を同定するには、細胞分画する必要がある。細胞分画をしていない場合、試料中での目的のタンパク質の有無はわかるが、細胞内のどこに局在しているか同定することはできない。また、試料イに含まれているタンパク質Ｘは、2−メルカプトエタノールとSDSの添加により変性しているため、エピトープとなる部位の構造が変化している可能性がある。そのため、anti−Ｘによるエピトープの認識をすることができず、細胞内局在の同定はできないと考えられる。

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